人巨噬細胞刺激蛋白ELISA檢測試劑盒實驗原理
發(fā)表時間：2025-05-14
人巨噬細胞刺激蛋白（MSP）ELISA檢測試劑盒的實驗原理基于雙抗體夾心法，通過特異性抗體對目標蛋白的高效捕獲與檢測實現(xiàn)定量分析。以下是實驗過程的詳細展開：
**1. 樣本預(yù)處理與加樣**
待測樣本（血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清）需經(jīng)離心去除雜質(zhì)，避免纖維蛋白原干擾。稀釋后的樣本與標準品同步加入預(yù)包被抗MSP單克隆抗體的微孔板中，37℃孵育1小時，抗體通過疏水作用與板壁牢固結(jié)合，形成固相免疫復(fù)合物。
**2. 洗滌與酶標抗體結(jié)合**
洗板機采用8道垂直沖洗，去除未結(jié)合蛋白后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗。該抗體針對MSP的不同表位設(shè)計，與捕獲抗體構(gòu)成"三明治"結(jié)構(gòu)，確保檢測特異性。45分鐘溫育過程中，酶標抗體與目標蛋白的濃度梯度呈正相關(guān)。
**3. 顯色反應(yīng)與終止**
TMB底物在HRP催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成藍色產(chǎn)物。反應(yīng)10分鐘后，硫酸終止液使溶液轉(zhuǎn)為黃色，此時450nm波長處的吸光度值與MSP濃度成正比。關(guān)鍵控制點包括：顯色時間需精確至±15秒，避免強光直射導(dǎo)致底物降解。
**4. 數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制**
酶標儀自動繪制標準曲線（通常R2≥0.99），未知樣本濃度通過四參數(shù)擬合計算。每板應(yīng)設(shè)置空白孔（僅緩沖液）、陰性對照（不含MSP樣本）及復(fù)孔（CV＜10%）。異常值需結(jié)合樣本稀釋線性（80%-120%回收率為合格）判斷是否重測。
**注意事項**
? 溶血樣本會釋放血紅素抑制HRP活性，需重新采集
? 板條開封后需密封防潮，避免抗體效價下降
? 冬季實驗時建議預(yù)熱洗液至25℃，防止洗滌不徹底
該技術(shù)可檢測低至15pg/mL的MSP，為研究巨噬細胞活化機制及炎癥性疾病提供精準工具。后續(xù)實驗可結(jié)合Western Blot驗證，或通過阻斷實驗確認抗體特異性。
